组织提取

1)、RNA isolater可以提取miRNA吗？

可以提取miRNA。本产品广泛适用于培养细胞、动物组织、微生物以及代谢较少的植物组织，如幼苗、幼叶等。

2)、RNA浓度不高

a)、原始组织样本或细胞量太少：提高加入量。

b)、RNA发生降解：如果使用者确定提取RNA的试剂/器具没有问题，RNA的降解通常发生在样品破碎/匀浆阶段。有两个办法可以彻底抑制内源RNase活性：1.立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆。这只适合培养细胞及内源RNase含量较低的并且较容易匀浆的组织；2.对于内源RNase含量高或不易匀浆的组织，如肝脏、胰腺、脾脏、肌肉等，或植物组织，需要切成小块后立即投入液氮冷冻，再按说明进行破碎/匀浆。

c)、加入异丙醇后室温沉淀10min或-20℃冰箱沉淀30min即可，无需过夜沉淀。

d)、根据白斑大小选择20-40ul DEPC水进行溶解。

3)、提取的RNA有基因组DNA污染

a)、向裂解液中加入氯仿后，需要在低温下(2-8°C)高速离心。离心后，RNA被抽提到上层的水相中，中、下层是有机相，含有氯仿。DNA即存在于中层。氯仿在常温下会与水以一定比例互溶，因此，常温离心会导致上层水相中也有少量基因组DNA污染。吸取上层液体时，应非常小心，避免吸到中间层和下层，为此牺牲一点得率，保留一些上清不吸，是非常值得的。

4)、RNA应如何保存

建议分装后在-80°C长期保存。在-20°C可以短期保存，但应尽快使用。

5)、RT-PCR反应失败

a)、RT-PCR是多步反应，应首先检查反应体系。在确认PCR以及逆转录反应体系没有问题的情况下，RNA降解是导致实验失败的***主要的原因?？梢匀∩倭啃孪侍崛』蚨炒娴腞NA跑1%琼脂糖凝胶电泳，检验完整性。以哺乳动物细胞/组织为例，完整的总RNA在胶上能看见清晰的三条带，分子量从大到小分别为28 s、 18 s,、5 s；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即开始逆转录反应，并适量增大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取。

b)、RNA的纯度影响后续反应：RNA isolater基于异硫氰酸胍法，主要杂质来自于异硫氰酸胍等盐的残留，对后续酶反应有很大的影响。因此需要用75%乙醇 (用DEPC水配制)仔细洗涤沉淀(轻弹管底让沉淀悬浮，并静置数分钟)。

组织保存

1)、RNA keeper可以保存血液血浆吗

不能。如果将白细胞从红细胞和血清中分离出来，并按组织培养细胞一样处理后，白细胞便能有效地保存在RNA keeper中。不要将全血、血浆或血清中的RNA保存在RNA keeper中，因为它们蛋白含量过高，与RNA keeper混合后易形成沉淀。

2)、RNA keeper可以保存******吗?

可以。RNA Keeper是抑菌的，虽然******在RNA Keeper中不能生长，但仍能保持其完整性。大肠杆菌保存在RNA keeper中，可4℃保存1个月。

逆转录

1)、PCR没有扩增产物

a)、RNase污染：总RNA提取完成后，建议取少量跑1%琼脂糖凝胶电泳，检验RNA的完整性。以哺乳动物为例，完整的总RNA在胶上能看见清晰的三条带，分子量从大到小分别为28 s、18 s、5 s；若能看见三条带，但带型模糊或弥散，则说明RNA有部分降解，此时请立即开始逆转录反应，并适量增大模板量；若只能看见分子量很小的一条带或没有条带，则RNA已完全降解，需要重新提取。

b)、RNA反应中含有逆转录抑制物：如酚、盐、SDS、EDTA等，建议用75%乙醇仔细洗涤RNA沉淀。

c)、目标区域有二级结构或高GC含量：加入随机引物进行逆转录，并将逆转录温度提高到55℃。

2)、非特异扩增

a)、基因组污染：使用Trizol类总RNA提取试剂，加入氯仿离心分层后，吸取上清时避免吸到中间层。PCR引物跨外显子拼接的边界设计PCR引物。

b)、PCR反应未优化：使用热启动的AceTaqTM HS DNA Polymerase(货号P401)，调整退火温度和Mg2+浓度。